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PCR反應條件的控制
日期：2024-11-23 00:26
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摘要：
PCR反應條件的控制：
PCR反應的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子
鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L
底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L
TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
引物 濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L
反應溫度和循環(huán)次數(shù)
變性溫度和時間 95℃，30s
退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸溫度和時間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循環(huán)次數(shù) ：一般...
PCR反應條件的控制：
PCR反應的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子
鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L
底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L
TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）
引物 濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L
反應溫度和循環(huán)次數(shù)
變性溫度和時間 95℃，30s
退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸溫度和時間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）
Tm值=4(G+C) +2(A+T)
循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。