日期：2024-11-22 18:25
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摘要：
PCR反應(yīng)要素優(yōu)化配置：
1、引物及濃度：
①長度：15～30bp。
②堿基：G+C含量以40%～60%為宜，ATGC 好隨機分布，避免5個以上的堿基成串排列。③避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)、兩條引物間互補，特別是3′端的互補。
④引物3′端的堿基，特別是末及倒數(shù)第2個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對。
⑤與其它序列無明顯同源性。⑥濃度為0.1～1μmol或10～100pmol。
2、酶及其濃度：
催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100μl時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3、...
PCR反應(yīng)要素優(yōu)化配置：
1、引物及濃度：
①長度：15～30bp。
②堿基：G+C含量以40%～60%為宜，ATGC 好隨機分布，避免5個以上的堿基成串排列。③避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)、兩條引物間互補，特別是3′端的互補。
④引物3′端的堿基，特別是末及倒數(shù)第2個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對。
⑤與其它序列無明顯同源性。⑥濃度為0.1～1μmol或10～100pmol。
2、酶及其濃度：
催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100μl時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3、dNTP的質(zhì)量與濃度：
dNTP應(yīng)為50～200μmol/L，4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），過高dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。
4、模板：
模板的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，避免DNA純化中的SDS和蛋白酶K等雜質(zhì)。
5、Mg2+濃度：
一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200μmol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
6、溫度與時間：
①變性：93℃～94lmin℃，過高或過低的溫度影響酶的活性。②退火：取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。一般高于Tm值5℃～10℃，時間為30～60s。③延伸：常用溫度為72℃，時間根據(jù)待擴增片段的長度而定。
7、循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。