熒光定量PCR內(nèi)標(IC)解讀
內(nèi)標(Internal Control,IC)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內(nèi)標有兩種形式,一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標,另一種是人工添加的內(nèi)標。內(nèi)標的大特點是與靶序列共同擴增,而其他的對照都是獨立擴增。
1、 內(nèi)參基因
通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內(nèi)參基因通常是持家基因(house-keeping gene)因為其表達水平受環(huán)境因素影響較小,而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續(xù)表達變化很小。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內(nèi)參基因的優(yōu)點是與樣品中的靶基因經(jīng)歷全相同的處理程序,可以監(jiān)控采樣,運輸,核酸提取和擴增的全部過程。缺點是不同物種,不同生理狀態(tài)下,不同組織中的內(nèi)參基因存在一定的差異。如果樣品類型是口腔液,咽拭子等樣品,內(nèi)參基因的量很低可能導致實驗不成立。如果檢測的是環(huán)境樣品則內(nèi)參基因可能全失效。
2、人工內(nèi)標
添加一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內(nèi)標?,F(xiàn)在國外的診斷試劑盒大部分都會將內(nèi)標直接添加在反應(yīng)液中與模板一起擴增,但是這樣的內(nèi)標不能監(jiān)控采樣,運輸和核酸提取的過程。
還有另一種形式的內(nèi)標,使用人工合成的假病毒,在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內(nèi)標,這樣就可以監(jiān)控樣品的提取到擴增的過程。但是由于是人工添加到樣品中,仍然不能監(jiān)控胞內(nèi)細 菌病毒的釋放情況。