細(xì)胞傳代步驟： 
如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

我司全程提供細(xì)胞生物體、生長特性、來源、器官、類型、形態(tài)、培養(yǎng)條件、應(yīng)用、組織、凍存條件等復(fù)蘇及凍存細(xì)胞株說明書信息，我們專業(yè)您的細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)，讓您實(shí)驗(yàn)再無煩擾！

產(chǎn)品名稱：A375-EGFP細(xì)胞

貨號(hào)：BJ-100346

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明 :

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法； 

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為玻璃**，并經(jīng)過鉻酸洗液處理； 

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕； 

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率； 

5．如果細(xì)胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

培養(yǎng)操作:

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。天換液并 檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。      

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。  

3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識(shí)。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

使用方法：

收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入完全培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的完全培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織完全被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

250mL FCS Blocking Buffer in PBS  FCS Blocking Buffer in PBS  常溫保存　　Granzyme B / GZMB 抗體, 兔單抗 ELISA   IHC-P    50 μg

50mL Ferrous Sulfate Solution（硫酸鐵溶液）,0.5M  Ferrous Sulfate Solution,0.5M  常溫保存　　IFNA5 / IFNaG 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 μg

250mL Formalin Solution in Phosphate Buffer,10%  Formalin Solution in Phosphate Buffer,10%  常溫保存　　IFNA5 / IFNaG 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

250mL Formalin-Acetic Acid Solution  Formalin-Acetic Acid Solution  常溫保存　　IFNA5 / IFNaG 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

250mL Formalin-Sodium Acetate Solution Formalin-Sodium Acetate Solution 常溫保存　　SMAC / Diablo 抗體, 兔單抗 ELISA   WB   IF  ICC/IF    50 μg

250mL Formalin-Zinc Acetate Solution Formalin-Zinc Acetate Solution 常溫保存　　SMAC / Diablo 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

250mL Formalin-Zinc Solution  Formalin-Zinc Solution  常溫保存　　SMAC / Diablo 抗體, 鼠單抗 ICC/IF    50 μg

250mL Galactose Solution（半乳糖溶液）,20%（W/V） Galactose Solution,20%（W/V） 常溫保存　　SLITRK1 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

500mL Gelatin Blocking Buffer in PBS   Gelatin Blocking Buffer in PBS   常溫保存　　SMAC / Diablo 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA   WB   IP   50 μg

500mL Gelatin Blocking Buffer in PBS with azide   Gelatin Blocking Buffer in PBS with azide   常溫保存　　SLITRK1 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

500mL Gelatin Blocking Buffer in TBS   Gelatin Blocking Buffer in TBS   常溫保存　　SMAC / Diablo 抗體, 兔多抗 ELISA   WB    400 μg

500mL Gelatin Blocking Buffer in TBS with azide   Gelatin Blocking Buffer in TBS with azide   常溫保存　　LFA-1 / CD11a / ITGAL / Integrin alpha L 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 IHC-P    50 μg

125mL Gelatin Solution,10%   Gelatin Solution,10%   常溫保存　　ICAM-1 / CD54 抗體 (PE), 鼠單抗 FCM    25 Test

A375-EGFP細(xì)胞植物總淀粉+直鏈+支鏈淀粉比色法定量檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

乳品酪蛋白比色法定量檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

食品添加劑酪蛋白比色法定量檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

麥芽β-葡聚糖酶比色法定量檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

大麥β-淀粉酶活性DNS比色法定量檢測(cè)試劑盒  進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

麥芽粉β-淀粉酶活性DNS比色法定量檢測(cè)試劑盒  進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

稻麥α淀粉酶活性DNS比色法定量檢測(cè)試劑盒  進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

土壤α淀粉酶活性DNS比色法定量檢測(cè)試劑盒  進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

大麥β-淀粉酶活性PNPG5酶偶聯(lián)比色法定量檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

麥芽粉β-淀粉酶活性PNPG5酶偶聯(lián)比色法定量檢測(cè)試劑盒 進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

稻麥α淀粉酶活性EPS-G7酶偶聯(lián)比色法定量檢測(cè)試劑盒  進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

土壤α淀粉酶活性EPS-G7酶偶聯(lián)比色法定量檢測(cè)試劑盒  進(jìn)口/國產(chǎn) 規(guī)格：20次

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