使用方法:

一、樣品 RNA 的制備

1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout

2、或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 μL 體系）

2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。

3. 嚴(yán)格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），

反應(yīng)終體積為 20μL。

4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。

訂購(gòu)信息：

產(chǎn)品名稱(chēng)：武氏盾螨熒光-PCR法

英文名稱(chēng)：Acarapis woodiPCR
貨號(hào)：BJ-01R3215

產(chǎn)品規(guī)格：50T

運(yùn)輸：低溫

保存：負(fù)20度

有效期：一年

貨期：現(xiàn)貨

【儲(chǔ)存條件及有效期】:

-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個(gè)月。

【適用儀器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運(yùn)輸】：

u 樣本采集：各類(lèi)型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)72h，-70℃以下可長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；

u 運(yùn)輸：采用**或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

本公司產(chǎn)品僅用于科研。

【自備試劑】:

核酸提取試劑，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

組成及試劑配制:

1、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

1）RT-PCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；

2）客戶(hù)盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱(chēng)和ID號(hào)；

3）客戶(hù)盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩類(lèi)，探針類(lèi)是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類(lèi)是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括量和相對(duì)定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的**量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)。

(3) 簡(jiǎn)便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。

(4) 對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。

3,4-Dimethylpyrazole (phosphate)  10μg  BQR-695 (NVP-BQR695)  1g  Z-Val-Val-OH  1mg

GPI-1485  1mg  Mefentrifluconazole  10mg  b NGF Human, CHO  10μg

2-Hydroxy-2-phenylacetic acid  1mg  CFI-400945  25g  LIN28 Human  1mg

(R)-(+)-Linoleyl-1’-Hydroxy-2’-Propylamide  10μg  C6 Ceramide (d18:1/6:0)  10mM*1mLinDMSO  IL 1 Alpha Porcine  5mg

YYA-021  5μg  PPOH  10mg  MYL5 Human  5mg

N-Oleoyl Leucine  100mg  Hexylene glycol (2-Methyl-2,4-pentanediol)  5μg  CPI-613  25g

Melanin probe-2  50mg  H-DL-Phe-OMe . HCl  5mg  MSX-122  500μg

LEE011  10mg  PPME1 Human  1mg  δ-CEHC  10mM(in1mLDMSO)

Leucettine L41  5mg  SARS Antibody  1mg  CID 5951923  1g

GSK3117391  5mg  Cy5 amine (non-sulfonated)  5mg  SKF 83959 hydrobromide  10mM*1mLinDMSO

NNT1 Human  25g  BRAF Human  5mg  TXN1 Human  50mg

RAC2 Human, 189a.a  10mM*1mLinDMSO  2-methyl-α-Pyrrolidinobutiophenone (hydrochloride)  5mg  L-Cysteine hydrochloride  5μg

Nucleosome Bovine  1mg  PKLR Human  10mg  Pro-xylane  100μg

ABC34  25μg  HG-9-91-01  1mg  O-1821  10mM*1mLinDMSO

JWH 019 N-(2-fluorohexyl) isomer  10mM(in1mLDMSO)  ubiquitin specific protease 3 fragment  10μg  CAY10577  10mg

武氏盾螨熒光-PCR法大黃酚 英文名稱(chēng)Chrysophanol 含量：HPLC≥98% 20mg/支 5-HTR2B  5-羥色胺受體2B抗體 0.1ml

蘆薈大黃素 英文名稱(chēng)Aloeemodin 含量：HPLC≥98% 20mg/支 5-HTR2A  5-羥色胺受體2A抗體 0.1ml

楊梅素 英文名稱(chēng)Myricetin 含量：HPLC≥99% 20mg/支 5-HTT  5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體 0.1ml

二氫楊梅素 英文名稱(chēng)Dihydromyricetin 含量：HPLC≥98% 20mg/支 5-HTR3  5-羥色胺受體3抗體 0.1ml

阿魏酸 英文名稱(chēng)Fumalic acid 含量：HPLC≥98% 20mg/支 5-HTR4  5-羥色胺受體4抗體 0.1ml

白藜蘆醇 英文名稱(chēng)Resveratrol 含量：HPLC≥98% 20mg/支 5 lipoxygenase/ALOX5  5-脂氧合酶抗體 0.1ml

虎杖苷（白藜蘆醇苷） 英文名稱(chēng)Polydatin 含量：HPLC≥98% 20mg/支 Phospho-5-Lipoxygenase(Ser271)  磷酸化5-脂氧合酶抗體 0.1ml

薄荷醇 英文名稱(chēng)I-menthol 含量：HPLC≥98% 20mg/支 Phospho-5-Lipoxygenase(Ser663)  磷酸化5-脂氧合酶抗體 0.1ml

丹皮酚 英文名稱(chēng)Paeonol 含量：HPLC≥99% 20mg/支 ALOX12/12 Lipoxygenase  12脂氧合酶抗體 0.1ml