使用方法:

一、樣品 RNA 的制備

1、用自選方法抽提病毒樣品 RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒 RNAout

2、或柱式病毒 RNAout。

二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 μL 體系）

2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。

3. 嚴格按順序加入 6μL RT Buffer（含 dNTP）和 2μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），

反應(yīng)終體積為 20μL。

4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，丌需要純化。

訂購信息：

產(chǎn)品名稱：蜂房小甲蟲熒光-PCR法

英文名稱：Aethina tumidaPCR
貨號：BJ-01R3239

產(chǎn)品規(guī)格：50T

運輸：低溫

保存：負20度

有效期：一年

貨期：現(xiàn)貨

【儲存條件及有效期】:

-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。

【適用儀器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運輸】：

u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；

u 運輸：采用**或泡沫箱加冰密封進行運輸。

本公司產(chǎn)品僅用于科研。

【自備試劑】:

核酸提取試劑，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

組成及試劑配制:

1、 酶標板：一塊（96孔）

2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

實驗注意事項：

1）RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準確的名稱和ID號；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進行定量（包括量和相對定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的**量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在學中zui小檢出率為3個。

(3) 簡便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

(4) 對標本的純度要求低

不需要分離病毒或及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活PCR技術(shù)概論。

Nicotinic Acid  50mg  Macrophage Inhibitory Peptide  10μg  LIMKi 3  20mg

Prostaglandin H1  50mg  Sorafenib  100mg  (S)-α-Methylbenzyl Ricinoleamide  100mg

Myristic Acid methyl ester-d27  5mg  (-)-Menthol  100mg  Methyl Salicylate (Wintergreen oil)  1g

1-Palmitoyl-2-Arachidonoyl-sn-glycero-3-PC  50mg  DMP 696  10mg  XEN723  10mg

Ro 90-7501  10mM*1mLinDMSO  RS 79948 hydrochloride  25g  Lythrine  100mg

Lagochiline  10mg  Roblitinib  1mg  AM 404  100μg

Gemcabene calcium  50mg  17(R)-HDHA  1mg  PKA-RII alpha  25μg

AT13387  1mg  Febuxostat  2mg  GTFTSDVSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS  25mg

Raphin1 acetate  20μg  Trilostane  5mg  EEF2K Human  25μg

(-)-L-threo-PDMP (hydrochloride)  5mg  A-395 (A395)  25g  ML-211  100mg

Diphenhydramine hydrochloride  25mg  BML-278  5μg  VEGFR2 Fc Human  0.5mg

PKACa2-RIIa2  10mg  FERb 033  10mg  D-Methioninol  100mg

H-DL-Nip-OH  5mg  BIX  50mg  Lorediplon  10mM(in1mLDMSO)

Seviteronel racemate  5mg  rec HIV-1 Protease (expressed in E. coli)  5mg  Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC  5mg

A 1120  5mg  H3R-IN-1 Hydrochloride  25mg  MLN120B  100mg

蜂房小甲蟲熒光-PCR法松脂醇二葡萄糖苷 英文名稱Pinoresinol diglucoside 含量：HPLC≥98% 20mg/支 ASB10  含錨蛋白重復(fù)序列-細胞因子信號抑制物盒蛋白家族10抗體 0.1ml

2,3,5,4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷 英文名稱2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene -2-o-glucoside 含量：HPLC≥98% 20mg/支 MARK4  絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MARK4抗體 0.1ml

貝母素甲 英文名稱Peimine 含量：HPLC≥99% 20mg/支 phospho-MARK4(Ser423)  磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MARK4抗體 0.1ml

貝母素乙 英文名稱Peiminine 含量：HPLC≥99% 20mg/支 phospho-TCF3/E2A/E47(Ser39)  磷酸化轉(zhuǎn)錄因子3抗體 0.1ml

連翹苷 英文名稱Forsythin 含量：HPLC≥98% 20mg/支 IgHV/IgH   球蛋白重鏈可變區(qū)抗體 0.2ml

三七皂甙R1 英文名稱Notoginsenoside R1 含量：HPLC≥98% 20mg/支 Mammaglobin A  乳腺珠蛋白1抗體 0.2ml

酸棗仁皂甙A 英文名稱Jujuboside A 含量：HPLC≥98% 20mg/支 ADK/AK  腺苷酸激酶抗體 0.1ml

酸棗仁皂甙B 英文名稱Jujuboside B 含量：HPLC≥98% 20mg/支 AEG-1/LYRIC  AEG-1抗體 0.2ml

酸棗仁皂甙D 英文名稱Jujuboside D 含量：HPLC≥98% 20mg/支 AMH/MIS  Muellerian繆勒管 抑制因子抗體 0.2ml