分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)特性技術(shù)介紹
目前,針對(duì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有多種技術(shù)方法,那么我們?cè)撊绾闻袛噙x擇哪種方法適合呢?我們需要去了解實(shí)驗(yàn)方法的特性。無(wú)非就是用某種特定的刺激物(如細(xì)胞活素)去刺激一些細(xì)胞或組織,讓它們high起來(lái),然后分析細(xì)胞對(duì)這些外源刺激物的反應(yīng),檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)哪條信號(hào)通路被激活或失活,或者什么蛋白被分泌出來(lái)。每一種實(shí)驗(yàn)方法都有它的特性,下面就以下幾種方法做介紹:
1、酶聯(lián)免 疫吸附劑測(cè)定(ELISA):
酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)如果要看看細(xì)胞外如何,比如細(xì)胞培養(yǎng)上清液或體液中的某種蛋白質(zhì)分泌情況,則通常選用ELISA,從而獲知相應(yīng)基因的活性。
2、表面等離子體共振(SPR):
表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)除了研究蛋白-蛋白相互作用(例如受體-配體相互作用),還有可研究小分子-蛋白或細(xì)胞-蛋白的相互作用。這種方法不需要標(biāo)記蛋白(熒光標(biāo)記或同位素標(biāo)記),還可以實(shí)時(shí)定量分析這些相互作用的親和力、熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)特性。SPR是分析動(dòng)力學(xué)和親和力的金標(biāo)準(zhǔn)。
3、電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA):
電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)初用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)的DNA序列結(jié)合的情況,可做定性和定量分析,包括細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子(如NF-kB )的活性等等,現(xiàn)在也常用于研究RNA結(jié)合蛋白和相應(yīng)的RNA序列相互作用。
這些分析用酶聯(lián)免 疫吸附實(shí)驗(yàn)(Eenzymelinked ImmunosorbentAssay,ELISA)也可以做,原理差不多。
4、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):
PCR(Polymerase Chain Reaction)或Real Time PCR可以把特定的DNA序列大幅擴(kuò)增,便于檢測(cè)活性基因的表達(dá)情況。而且PCR用途很廣。
5、免 疫印跡實(shí)驗(yàn)(WB):
免 疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot,WB)可檢測(cè)信號(hào)通路中某種蛋白質(zhì)的特性、表達(dá)和分布,分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)。建立蛋白質(zhì)的個(gè)人檔案。
但至于蛋白-蛋白相互作用則要用另一種復(fù)雜的方法,即免 疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation,Co-IP),它接近細(xì)胞內(nèi)的生理情況,是以成為經(jīng)典方法。